革新脑科学研究的光学方法
SCALEVIEW系列
SCALEVIEW系列是用于ScaleS法的试剂。ScaleS法是一项由国立研究开发法人理化学研究所的宮脇敦史老师等人开发的，使用以尿素为主要成分的试剂溶液的透明化技术。SCALEVIEW不仅可以透明化含荧光蛋白的活体样品，还可以有效地利用抗体或荧光染料标记厚标本，作为脑组织、球体和类器官的分析工具备受期待。
◆Scale法是什么？
传统透明化技术中常使用有机溶剂，但在发光过程中，需要水分子的荧光蛋白在此条件下会明显褪色。
针对该问题，研究人员开发了使用水溶液的透明化技术——Scale法（ScaleA2法和ScaleS法的总称）1-2）。
Scale法使用尿素、表面活性剂、甘油（ScaleA2法）或山梨醇（ScaleS法）的混合溶液来抑制光散射，从而实现组织透明化的同时荧光蛋白不褪色。此外，脱脂所需的表面活性剂含量少，透明化后也可保持良好的超微结构。
初次尝试组织透明化的用户，推荐使用这种能较好平衡透明度和结构保持的Scale法。
图1. PI染色的YER-H line小鼠大脑半球切片
数据提供：日本国立研究开发法人理化学研究所 脑神经科学研究中心细胞机能探索技术研究小组/光量子工学研究中心生命光学技术研究小组 濱裕老师、星田哲志老师、宮脇敦史老师（赞助：奥林巴斯株式会社）
特点
● 操作简便（仅需将组织依次浸入溶液）
● 约1日即可完成2 mm脑组织块的透明化
● 透明化后可用于荧光染料染色（ChemScale）和免疫组织染色（AbScale或AbScale-G）
适用样品
小鼠脑、人死后脑、骨骼（需脱钙处理）、类器官/球体等
◆选择指南
应用 | 荧光蛋白 | 荧光染料 | 标记抗体（免疫染色） | ||
方法 | ScaleS | ChemScale | AbScale | AbScale-G | |
所需试剂 | ✔ | ||||
✔ | ✔ | ✔ | |||
SCALEVIEW-S0 | ✔ | ✔ | ✔ | ||
✔ | ✔ | ✔ | |||
deScale solution | ✔ | ✔ | ✔ | ✔ | |
AbScale-G Solution Kit | ✔ | ||||
所需时间 | 约1天 | 约4~7天 | 约4~7天 | 约4~7天 | |
备注 | • 可与荧光蛋白共染色 | • 可与荧光蛋白共染色 | • 可与荧光蛋白共染色 | ||
各试剂的说明
▼ SCALEVIEW-S Trial Kit
本试剂盒包含6种类型的溶液：SCALEVIEW-S0、SCALEVIEW-S1、SCALEVIEW-S2、SCALEVIEW-S3、SCALEVIEW-S4、SCALEVIEW-SMt。通过将组织浸入各溶液中，即可快速简便地实现透明化，并对折射率进行调整。
▼ SCALEVIEW-A2
基于2011年报告的透明化方法Scale的透明化溶液。折射率（20℃）较低，设定为RI = 1.377-1.381，无需高昂的显微镜设备也可轻松匹配折射率，推荐初次尝试透明化的用户使用。
▼ deScale solution
ScaleS法的清洗步骤中使用的试剂。
简单透明化球体
仅使用SCALEVIEW-S4透明化球体的protocol3）和实验数据可参考SCALEVIEW-S4的产品页面。
其他所需的仪器、器材和试剂
▼仪器、器材
● 荧光显微镜
● ※ 请根据折射率（SCALEVIEW-A2: RI=1.38, SCALEVIEW-S4: RI=1.47, SCALEVIEW-SMt: RI=1.49）选择合适的物镜。
● 建议在获取数据之前与您使用的显微镜厂家进行联系。
● 锥形管（请根据样品，选择5 mL/15 mL/30 mL/50 mL）
● 塑料培养皿（请根据样品，选择直径35 mm、直径60 mm或直径100 mm）
● 摇床
▼试剂
● 多聚甲醛（产品编号：160-16061）
● 1 × PBS (产品编号：164-25511)
● 琼脂糖
◆数据
脑组织
ScaleS：小鼠脑切片及脑半球的透明化
▼Protocol
灌注固定+后固定 | 透明化 | 清洗 | 透明化 | 观察 | |||||
4%PFA/PBS(-) | PBS(-) | SCALEVIEW-S0 | SCALEVIEW-S1 | SCALEVIEW-S2 | SCALEVIEW-S3 | deScale Solution | SCALEVIEW-S4 | SCALEVIEW-SMt | SCALEVIEW-SMt |
4°C | RT | 37°C | 37°C | 37°C | 37°C | 4°C | 37°C | 37°C | RT |
各溶液的使用量（以小鼠脑半球1~2 mm的厚切片为例*）
【透明化】SCALEVIEW-S0/S1/S2/S3：各5 mL / deScale Solution 5 mL
【观 察】SCALEVIEW-SMt：5 mL
*试剂的使用量和处理时间因样品尺寸而异。
ScaleS：YFP-H系统小鼠全脑透明化
| 物种：小鼠 (Thy1-YFP-H line, 20W, ♂) 组织：全脑 显微镜：多光子激光扫描显微镜 (Evident，FVMPE-RS) 物镜：XLPLN10XSVMP (NA 0.6) 激光：960 nm （YFP） 图像尺寸：512 x 512, 170 tiles, Z=8,000 μm, Z Step 16 μm |
ScaleS：透明化小鼠脑切片并使用荧光标记的凝集素观察血管
| 物种：小鼠（C57BL6/J、10.5日龄) 组织：大脑冠状切面 (1.2 mm厚) 显微镜：共聚焦激光扫描显微镜（正置式） 凝集素：Texas Red标记 番茄凝集素 |
ScaleA2：YFP-H系统小鼠全脑透明化
物种：小鼠 组织：全脑 物镜：XLSLPLN25XSVMP (NA 0.90, WD 8 mm) |
ScaleA2：YFP-H系统小鼠海马透明化
物种：小鼠 组织：海马体 物镜：XLPLN25XSVMP (NA1.0, WD 4 mm) |
ChemScale：YFP-H系统小鼠脑半球切片的Propidium iodide (PI) 染色和透明化
| 物种：小鼠（Thy1-YFP-H line, 42W, ♂) 组织：大脑（冠状面切片, 2 mm厚） 显微镜：共聚焦激光扫描显微镜（Evident，FV3000，倒置式） 物镜：UPLSAPO10x2 (NA 0.40) 激光：488 nm (YFP) / 561 nm (PI) |
▼Protocol（详细protocol）
灌注固定+后固定 | 前处理 | 荧光染料染色 | 透明化 | 观察 | |||||||
4% PFA/PBS(-) | PBS(-) | SCALEVIEW-S0 | SCALEVIEW-A2 | 8M 尿素 | SCALEVIEW-A2 | deScale Solution | 蛍光染料* | SCALEVIEW-A2 | deScale Solution | SCALEVIEW-S4 | SCALEVIEW-S4 |
4°C | RT | 37°C | 37°C | 37°C | 37°C | 4°C | RT | RT | 4°C | 37°C | RT |
*荧光染料例：125 nM SYTO™61 (Thermo Fisher Scientific), 500 nM DAPI, 1 μM PI
各溶液的使用量（以小鼠脑半球1~2 mm的厚切片为例）
【前处理】SCALEVIEW-S0：10 ｍL / SCALEVIEW-A2：10 mLx2 / deScale Solution10 mL
【染 色】染色溶液：8 mL /deScale Solution：10 mL
【透明化】SCALEVIEW-S4：10 mL
【观 察】SCALEVIEW-S4：10 mL
AbScale：阿尔茨海默病模型小鼠脑切片的免疫组织化学染色和透明化
| 物种：小鼠（阿尔茨海默病模型，17月龄) 组织：大脑切片（2 mm厚） 显微镜：共聚焦激光扫描显微镜（Evident，FV1200，倒置式） 物镜：XLPLN10XSVMP (NA 0.60) |
▼Protocol
灌注固定+后固定 | 前处理 | 免疫染色 | 透明化 | 观察 | |||||||||
4% PFA/PBS(-) | PBS(-) | SCALEVIEW-S0 | SCALEVIEW-A2 | 8M尿素 | SCALEVIEW-A2 | deScale Solution | 1% 封闭剂*/PBS(-) | 抗体/AbScale Solution** | AbScale Solution** | 4% PFA/PBS(-) | deScale Solution | SCALEVIEW-S4 | SCALEVIEW-S4 |
4°C | RT | 37°C | 37°C | 37°C | 37°C | 4°C | RT | 37°C | RT | 4°C | 4°C | 37°C | RT |
* 推荐试剂：Roche公司 产品编号：11096176001
** AbScale溶液：含0.33 M尿素和0.1％（wt/vol）Triton X-100的PBS(-)溶液（自行配制）
各溶液的使用量（以小鼠脑半球1~2 mm的厚切片为例）
【前处理】SCALEVIEW-S0：10 ｍL / SCALEVIEW-A2：10 mL×2 / deScale Solution：10 mL
【染 色】AbScale Solution：1.5 mL /deScale Solution：10 mL
【透明化】SCALEVIEW-S4：10 mL
【观 察】SCALEVIEW-S4：10 mL
AbScale-G：阿尔茨海默病模型小鼠脑切片的免疫组织化学染色和透明化
| 物种：小鼠（阿尔茨海默病模型，60周龄) 组织：大脑切片（1 mm厚） 显微镜：共聚焦激光扫描显微镜（Evident，FV1200，倒置式） 物镜：XLPLN10XSVMP (NA 0.60)
<数据提供>日本国立理化学研究所脑科学中心 细胞功能发现技术研究团队 滨老师 |
AbScale-G改善了传统方法中难以染色的Cy3等荧光染料的渗透性，可以与多种荧光染料和抗体一起使用。
▼Protocol
灌注固定+后固定 | 前处理 | 免疫染色 | 透明化 | 观察 | |||||||
4% PFA/PBS(-) | PBS(-) | SCALEVIEW-S0 | SCALEVIEW-A2 | 8M尿素 | SCALEVIEW-A2 | deScale Solution | 抗体 /AbScale-G Solution | AbScale-O Solution* | 4% PFA /PBS(-) | SCALEVIEW-S4 | SCALEVIEW-S4 |
4°C | RT | 37°C | 37°C | 37°C | 37°C | RT | 37°C | RT | RT | 37°C | RT |
* AbScale-O 溶液：含0.33 M尿素和0.1% (wt/vol) Triton X-100的PBS(-)溶液（自行配制）
各溶液的使用量（以小鼠脑半球1 mm的厚切片为例）
【 前 处 理】SCALEVIEW-S0: 6 ｍL / SCALEVIEW-A2: 6 mLx2 / deScale Solution: 10 mL
【免疫染色】AbScale-G Solution: 1.5 mL /deScale Solution: 10 mL
【透 明 化 】SCALEVIEW-S4：8 mL
【观 察】SCALEVIEW-S4：8 mL
球体和类器官
AbScale：大鼠海马神经干细胞来源神经球的免疫染色和透明化
| 物种：成年大鼠海马神经干细胞来源神经球 显微镜：共聚焦激光扫描显微镜（Evident，FV1000） 物镜：UMPLFLN10XW (NA 0.3) |
▼Protocol
灌注固定+后固定 | 前处理 | 免疫染色 | 透明化 | 观察 | |||||||||
4% PFA | PBS(-) | SCALEVIEW-S0 | SCALEVIEW-A2 | 8M 尿素 | SCALEVIEW-A2 | deScale Solution | 1% 封闭剂* /PBS(-) | 抗体 /AbScale Solution** | AbScale Solution** | 4% PFA /PBS(-) | deScale Solution | SCALEVIEW-S4 | SCALEVIEW-S4 |
4°C | RT | 37°C | 37°C | 37°C | 37°C | 4°C | RT | 37°C | RT | 4°C | 4°C | 37°C | RT |
* 推荐试剂：Roche公司 产品编号：11096176001
** AbScale溶液：含0.33 M尿素和0.1％（wt/vol）Triton X-100的PBS(-)溶液（自行配制）
各溶液的使用量
【 前 处 理】SCALEVIEW-S0：1.2 ｍL / SCALEVIEW-A2：1.2 mL / deScale Solution：1.2 mL
【免疫染色】以AbScale的Protocol为准
【 透 明 化】SCALEVIEW-S4：1.2 mL
【观 察】SCALEVIEW-S4：1.2 mL
AbScale：人iPS细胞来源肝细胞（iCell® Hepatocytes2.0）的免疫染色和透明化
明亮视野 |
FITC |
明亮视野+ FITC | 样品：iCell® Hepatocytes2.0 球体形成板：Prime Surface® 96孔板 一抗：抗ABCB11抗体 二抗：抗兔IgG(H+L)，山羊，FITC标记 |
▼Protocol
| ▶ |
| ▶ |
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| iCell® Hepatocytes2.0在平板培养中成熟化 | 使用球体形成板制备球体 | 使用SCALEVIEW透明化 |
点击此处查看相关产品宣传册：组织透明化试剂（第3版）
◆关于操作
Q1：透明化中的样品会膨胀吗？
A1：样品几乎不会发生变化，但在透明化过程中可能会略微膨胀。在最后的透明化过程中，样品会恢复到与最初差不多的大小。
Q2：透明化过程中是否可以中途暂停？
A2：[AbScale, AbScale-G, ClemScale的前处理步骤]
在SCALEVIEW-S0, A2的处理过程中，4℃条件下可放置12 hrs～3 days左右。
Q3：透明化后的样品该如何保存？
A3：请将样品置于SCALEVIEW-S4溶液中避光保存，并使用parafilm封口膜等防止干燥。
◆关于观察
Q1：荧光蛋白的信号能保持多久？
A1：约6个月。
Q2：推荐使用什么样的容器进行观察？
A2：请使用比组织样品稍大的培养皿，或与样品厚度相适应的透明室进行观察。
Q3：推荐使用哪一种显微镜？
A3：请使用共聚焦显微镜、双光子显微镜等。此外，也请使用与SCALEVIEW-S4（RI=1.47）和SCALEVIEW-SMt（RI=1.49）折射率相匹配的物
A3：镜，或咨询您使用的显微镜厂家。
【Tips】如没有适配的显微镜，且在高折射率条件下难以进行观察，请考虑更换为SCALEVIEW-A2（RI = 1.38）进行观察。
| 1） | Hama, H. et al.: Nat Neurosci., 14, 1481 (2011). |
| 2） | Hama, H. et al.: Nat Neurosci., 18, 1518 (2015). |
| 3） | Boutin, M. E. et al.: Sci. Rep., 8(1), 11135 (2018). |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 299-79901 | SCALEVIEW-S Trial Kit SCALEVIEW-S试剂盒小包装 |
1 Kit | 组织透明化用 | |
| 193-18455 | SCALEVIEW-A2 SCALEVIEW® 组织透明化试剂A2 |
500 mL | 组织透明化用 | |
| 196-18521 | SCALEVIEW-S0 SCALEVIEW® 组织透明化试剂S0 |
250 mL | 组织透明化用 | |
| 194-18561 | SCALEVIEW-S4 SCALEVIEW-S4组织透明化试剂 |
250 mL | 组织透明化试剂 | |
| 041-34425 | deScale Solution 透明化洗涤溶液 |
500 mL | 组织透明化试剂 | |
| 293-97001 | AbScale-G Solution Kit | 1 Kit | 组织透明化试剂 |
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