MBT2（膀胱癌）

MBT2是一株源自小鼠膀胱癌的细胞系，该细胞系具有良好的体外增殖能力，是构建膀胱癌同系移植瘤模型的经典工具，广泛应用于肿瘤免疫学、癌症机制研究等领域。

◆细胞基本信息

◆产品特性

● 高致瘤性，常用于构建同系移植瘤模型

● 膀胱癌免疫治疗研究的重要工具

● 高增殖率与侵袭性

● 细胞来源：膀胱癌（小鼠），雌性，细胞系建立于1985年

相关资料

● 培养基使用建议

● 细胞系首次培养指南

培养基使用建议

请参考细胞系数据页或产品特性页细胞基本信息表格中的培养基。

【选择要点】

通常，每款经典培养基都只有一个标准配方，但厂家也会提供许多改良产品，例如不含L-谷氨酰胺、含HEPES等配方。

L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺是所有哺乳动物细胞培养的必需氨基酸之一，所有培养基最后都应含有L-谷氨酰胺。然而，部分市售培养基并不含该成分，因为其在水溶液中稳定性较差，不适合在液体培养基中长期储存。如果您的培养基中不含该氨基酸，需另行添加。部分培养基含有其稳定替代物，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（例如GlutaMAX™、glutagro™）。

HEPES

通常而言，HEPES并非MEM、DMEM，RPMI 1640和Ham's  F-12等经典培养基的标准成分。HEPES有时被用于强效pH缓冲，但并非必需成分。

酚红

酚红是pH指示剂，通常包含在培养基中。

Eagle最低必需培养基（MEM）

- Earle's盐和Hank's盐：

如需在CO₂培养箱中培养，请选择Earle's盐配方。

-非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸钠：

NEAA和丙酮酸钠不是MEM的标准成分。

杜氏改良Eagle's培养基（D-MEM）

-低糖型与高糖型，丙酮酸钠：

标准配方为低糖型（1 g/L），高糖型（4.5 g/L）为改良版。除特别说明外，JCRB通常使用低糖型配方。丙酮酸钠是DMEM的标准成分之一。

抗生素

细胞培养中可使用抗生素，例如100 units/mL青霉素+100 ug/mL链霉素。不建议添加Fungizone（两性霉素B），它会抑制某些细胞类型的生长。

FBS（胎牛血清）和FCS（胎牛血清）

FBS和FCS是同一物质。

相关培养基产品

JCRB细胞库基本上使用标准配方的培养基。下表列举了采用标准配方的液体培养基产品。

细胞系首次培养指南

收到细胞后

细胞系到货后，请迅速将细胞从包装中转移至存储场所或进行培养。

冷冻细胞在-65℃以上会快速受损。

运输冻存管时，应使用干冰或少量液氮进行冷却。切勿使用冰（0℃）冷却冻存管，因为这样反而会升高其温度，导致细胞存活率降低。

首次培养指南

培养基和设备

○ 为避免过度稀释，请使用25 cm² 的培养瓶或6 cm的培养皿（或数据表中指定的更小的容器尺寸）

○ 根据产品详情页中的细胞基本信息准备合适的培养基。

应快速复苏细胞

【请逐支操作，切勿同时解冻两支或以上的安瓿瓶。】 1. 从包装中取出一支安瓿瓶。（请佩戴安全手套与防护面罩） 2. 立即将安瓿瓶放入温水中（＜ 37℃），摇晃并在2 分钟内解冻内容物。

接种至 25 cm² 培养瓶或 6 cm 培养皿

    如果数据表中特别推荐了培养基的用量，请按照说明进行操作。

9. 在25 cm²培养瓶或6 cm培养皿中组织培养。

    随附数据表中的细胞密度为对数生长期的标准密度，并非复苏时的实际密度。

10. 进行传代前，请确认细胞已恢复增殖。可能需要数天乃至一周的时间才能增殖。待细胞生长良好后，尽早制备冻存株。

Q&A

◆操作方法

Q. 收到细胞后，首先应该做什么？

A. 确认安瓿瓶是否破损，然后在液氮罐等容器中储存。

尽管细胞在运输中已格外注意，但运输过程中仍可能发生破损。请检查以下几点：

1. 运输容器是否破损？

2. 干冰是否维持了足够低温的环境？

3. 装有细胞的容器是否破损？

4. 收到的细胞是否与订单内容一致？

若不立即培养，请将细胞在液氮罐等容器中储存。

Q. 如何开启玻璃安瓿瓶？

A. 细胞储存于安瓿瓶中，请注意并按照以下方法开启。

注意1

本细胞库使用玻璃安瓿瓶储存细胞。因此从液氮罐中取出时可能会发生爆炸，请万分小心！！！从液氮（液相）中取出时必须穿长袖实验服，戴厚手套，着防护面罩，不要暴露手臂和脸等皮肤部位。

注意2
因使用硬质玻璃，需大力开封，易导致手指割伤，请小心。

· 开启方法(需准备物品：灭菌纱布、消毒用酒精、2 mL移液管)

1. 在离心管中准备约10 mL培养基。

2. 在37度左右的温水中融解安瓿瓶，用消毒用酒精充分擦拭安瓿瓶的颈部。

3. 用灭菌纱布包裹安瓿瓶瓶身。

4. 隔着纱布握住安瓿瓶瓶身，拇指用力按压安瓿瓶头部，将其颈部折断。

5. 缓慢打开纱布，取出安瓿瓶，使用2 mL移液器等采集细胞悬液，转移至1）中准备好的离心管中，1000-1200 rpm条件下离心3-5分钟沉淀

    细胞。

6. 离心后去除上清液，在新鲜的培养基中重悬沉淀（离心1次）

7. 细胞计数和细胞活力检测后，开始培养。

Q.细胞不增殖

A.可能是由于培养基、培养环境、细胞等存在问题。

（关于细胞质量（特别是增殖能力）的投诉等，仅限发货后3个月内受理）

Ⅰ 培养基

初始培养时请务必使用细胞信息表中指定的培养基。若使用指定以外的培养基，则无法提供保证。首先使用指定的培养基，确认细胞增殖状况，如必要，之后可以尝试使用自己的培养基。

1. 培养基是否放置过久？冷藏条件下，液体培养基建议3个月内使用、粉末培养基建议12个月内使用。

2. 保存状况是否不佳？是否存在反复加热、或是保存温度不当等情况导致培养基发生变质？

3. 是否按要求添加了血清和生长因子？血清的批次差异、厂家差异会对细胞增殖产生显著影响。而血清以外的增殖因子，可能因浓度不当或操作不

    当致其失活。

4. 增殖培养基的pH值是否合适？使用粉末配制培养基时，有些需要调整pH值。

5. 是否按要求添加补充剂？使用粉末培养基制备时，有时需要用户添加碳酸氢钠、HEPES 等成分。尤其对于高温高压灭菌的培养基，使用前

    必须添加已单独灭菌的碳酸氢钠及 L - 谷氨酰胺。 

Ⅱ 培养环境

建议一年校准一次CO2孵育箱，并定期清洁维护。

1. 温度是否合适？

2. 湿度是否合适？孵育箱内的加湿水槽中水量是否充足？

3. CO₂浓度是否合适？气瓶是否已耗尽？

Ⅲ 细胞

如果复苏和培养操作不当，后续细胞培养将非常困难。

1. 细胞密度是否合适？细胞密度低会导致细胞增殖开始时间延迟。

2. 细胞活力是否偏低？就悬浮细胞而言，由于活细胞与死细胞难以分离，所以培养开始前必须进行确认。

3. 是否确认细胞的分裂速度？不同细胞分裂所需的时间不同。快的细胞约12小时，慢的细胞则需2~3 天分裂一次。一般来说，癌来源细

    胞和血液细胞最快可在 24 小时内分裂，正常细胞相对较慢，通常需要 24 小时以上。

4. 是否出现了分化和老化？分化和老化会导致细胞停止增殖，请严格遵守培养条件。

5. 更换培养基的频率是否合适？更换培养基的时机因细胞密度而异，低密度的情况下请适当延长更换时间。

6. 是否在合适的时期进行传代培养？对于贴壁细胞，当其达到汇合状态后，部分细胞可能出现细胞死亡和分化等性状改变。而悬浮细胞达到最大

    细胞密度后，许多细胞会出现活力急剧下降的情况。

Q. 安瓿瓶上信息的含义？

A. 细胞编号，细胞名，传代次数等信息。

Q. 细胞应如何储存？

A. 请在液氮罐等容器内储存。（请勿在－80℃下长期储存）

一般认为细胞在液氮中可半永久储存。如果冻存细胞的存活率低，很可能是在冻存期间或取用其他细胞时，因某种原因导致温度上升。在－80℃超低温冰箱中，细胞可保存半年至一年左右，但存活率会随时间慢慢下降。

Q. 血清如何灭活？ （什么是血清灭活？）

A. 灭活血清中的补体成分，需在56℃条件下加热处理30分钟。

血清中的补体成分活化，可能会导致细胞受损，因此需将血清在56℃下加热30分钟使补体成分失活。

◆培养基、试剂

Q. 如何选择细胞培养用的培养基？（可以使用和细胞信息不同的培养基吗？）

A. 原则上请使用细胞信息中记载的培养基。

关于论文等中记载的培养条件，本细胞库尚未完全确认，因此无法解答。关于培养基与培养基添加剂，原则上没有指定厂家，请根据需求准备所需试剂并制备培养基。

Q. 培养基中是否需要添加抗生素？

A. 本细胞库常规培养细胞培养时，原则上不添加抗生素进行培养。

本细胞库的细胞由熟练的技术人员在洁净的环境中培养，细菌等污染混入的可能性非常低，通常不添加抗生素进行培养。这有助于避免对细胞造成非预期的影响，并防止耐药菌的出现。

◆质量管理

Q. 细胞被支原体污染了怎么办？

A. 建议重新购买可购买（获取）的细胞。

一旦确认细胞被支原体污染，基于以下原因，建议重新购买可购买（获取）的细胞。

1. 无法明确支原体污染的时间点。

2. 清除支原体污染需要大量时间。

3. 即便成功清除污染，细胞的性状也有可能发生改变。

JCRB细胞库出售的细胞，经检测均无支原体污染，可以放心使用。

◆生物安全

Q. 请告知处理细胞时需要的生物安全等级（BSL）。

A. 请在BSL-2下处理所有人源细胞。

JCRB细胞库会对人源细胞进行病毒检测，但因检测的局限性以及未知病毒存在的可能，所以请在BSL-2条件下处理细胞。此外，其他动物物种中，一些病毒生产细胞也需在BSL-2条件下处理。

◆关于发货

Q. 请详细介绍JCRB细胞库在运输细胞时采用的运输方法。

在日本运输细胞的示例程序（包装和干冰）。

冻存管放在填满干冰的泡沫箱中发货。夏季（6-9月）采用冷链运输，其他时间（10-5月）不特别指定冷链配送。

具体来说，对于一般的细胞株采用以下方法。

细胞冻存管包装

如下方照片所示，在塑料管的上下填充脱脂棉，将细胞冻存管放置在中间。

如果数量较多，则使用纸盒。

● 放入冻存管前，需要用液氮冷却已填充脱脂棉的外装塑料管。

● 如果液氮进入内部，取出时会气化并急剧膨胀，导致试管破裂。因此，冷却时务必要盖紧盖子。（或置于液氮罐中气体冷却）。

干冰

上述规格的泡沫箱中，约放入7 kg干冰。

1. 首先，用干冰板完全覆盖箱底和侧面。

2. 填充干冰至刚好能放入塑料管或盒子的空间。

3. 如果有缝隙，就将干冰敲碎后尽可能填满。

4. 顶部放干冰，像盖子一样盖住。

5. 尽可能上下左右全部填满干冰。

此外，上述是JCRB细胞库的发货示例，用户自行寄送冻存细胞时，使用试剂供应商处获得的、尺寸合适的泡沫箱即可，外箱非必需。

如果填充10 kg左右干冰，基本可以维持1天，可以根据包装进行尝试。

◆其他

Q. 购买的细胞能否转让给他人？

A. 原则上禁止转让给第三方。

在细胞出售时，购买申请人必须签署 “Request and Agreement Form (Form A)”，其中明确记载了禁止向第三方转让细胞的相关内容。这是为了保护细胞建立者的知识产权，也是为了保证本细胞库提供的细胞的品质，因此还请您理解并配合。如果您对此有疑问，可随时联系我们。

参考文献