KM12-Luc（稳定表达荧光素酶的人结肠癌细胞系）

结肠癌患者来源。转染了pMSCV-Luc载体，具有明确的结肠癌背景及稳定表达荧光素酶的特征。

◆细胞基本信息

◆产品特性

●稳定表达荧光素酶（pMSCV-luc转染）

●药物开发的体内和体外成像分析用

●嘌呤霉素耐药

●结肠癌，年龄不详，男性，细胞系建立于2009年

◆其他表达荧光素酶的癌细胞

相关资料

● 订购Luc细胞系

● 荧光素酶基因导入细胞系的信息

● 培养基使用建议

● 细胞系首次培养指南

订购Luc细胞系

【关于发光细胞（荧光素酶表达细胞）】

Luc细胞系的出售，需要海外用户与细胞系建立者之间另行签订额外的MAT。

接收出售申请后，JCRB将MAT表格发给申请者。

申请书请尽可能详细地描述研究目的。

更多详情，请联系当地代理商/JCRB。

另外，关于该发光细胞，请在发表的论文中对细胞建立者村上老师提供细胞表示感谢。

细胞建立者

村上 孝 (Takashi Murakami M.D., Ph.D.)

〒350-0495

埼玉县入间郡毛吕山町毛吕本乡38

埼玉医科大学医学部 微生物学

荧光素酶基因导入细胞系的信息

荧光素酶基因的来源

Luciferase基因的来源物种：北美萤火虫（学名 Photinus pyralis）

基因： pGL3-luciferase（Promega）

相应的序列是Genbank ACC U47295，CDS 88..1740。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U47295

使用的载体

导入荧光素酶基因时使用的载体是以下之一。请在产品页的细胞基本信息中确认所使用的载体。

・pMSCV-Luc

・pLVSIN-Luc

・pLL3.7-CMV-Luc

pMSCV-Luc（逆转录病毒载体）

pMSCV-luc是通过在pMSCVuro的XhoI-EcoRI位点插入pGL3荧光素酶基因构建的。选择标志是嘌呤霉素耐药性。

载体图谱请参考本文末资料。

pLVSIN-Luc（慢病毒载体）

pLVSIN-Luc 是通过在pLVSIN-CMV-pur或pLVSIN-EF1a-pur的XhoI-XbaI位点插入pGL3荧光素酶基因构建的。选择标志是嘌呤霉素耐药性。

载体图谱请参考本文末资料。

pLL3.7-CMV-Luc（慢病毒载体）

pLL3.7/CMV-Luc是通过将pGL3荧光素酶基因插入pLL3.7载体构建的。

pLL3.7载体中包含的EGFP基因在pLL3.7/CMV-Luc中被消除。

此载体不含抗性筛选基因。

载体图谱请参考本文末资料。

抗生素的选择

据建立者，可以使用嘌呤霉素2.5~4 μg/mL筛选含有puromycin抗性基因的细胞。然而，药物敏感性因细胞种类而异，尝试药物筛选时，请进行不同浓度的测试。

由于这些细胞是以稳定表达株的形式委托存储，JCRB并未进行抗性筛选。然而，存在这样一种可能性：表达荧光素酶的细胞数量可能会因基因沉默和群体筛选而减少。因此，我们建议在细胞生长良好的早期准备细胞系的冷冻储备，以避免细胞系特性的丧失或微生物污染等意外损失。

关于安全性

在JCRB细胞库注册的luciferase基因导入发光细胞，使用了下列载体之一：

・pMSCV-Luc逆转录病毒载体

・pLVSIN-Luc慢病毒载体

・pLL3.7-CMV-Luc慢病毒载体

其中，对于使用慢病毒载体导入的人细胞，慎重起见进行了逆转录酶检测，确认可出售细胞为阴性。

并且，所使用的病毒载体为复制缺陷型（replication incompetent），导入细胞后不会发生复制。此外，经过长期传代，由于病毒随时间推移的变性、稀释效应等，残留病毒被认为可忽略。

然而，对于人类细胞系，除基因导入的问题外，还可能会存在未经JCRB细胞库检测的病毒以及未知病毒等，原则上建议在BSL2条件下进行操作。

关于《卡塔赫纳生物安全议定书》

导入荧光素酶（Luciferase）的发光细胞株本身不属于“转基因生物”。仅处理细胞时，不属于重组DNA实验，不受生物安全封闭防护等级 2级（P2）的限制。

另一方面，进行发光细胞移植至动物的实验时，将外源基因荧光素酶导入动物，使这些动物成为“转基因生物”，受《卡塔赫纳生物安全议定书》的制约。

[解说]

《卡塔赫纳生物安全议定书》适用于转基因生物。

根据日本『遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律』（译为：《通过规制转基因生物等的使用等确保生物多样性的法律》）的实施条款中，转基因生物的豁免条款如下：

（生物的定义）第一条之1和2

“人类细胞等“，

“具有分化能力或已分化，但在自然条件下不发育为个体的细胞等（不包括个体及配子）“，

上述条款表示即使是经过转基因的哺乳动物（如人）的培养细胞，也不属于法律定义的转基因生物。

转基因使用的病毒虽然属于转基因生物，但由于其为复制缺陷型（replication incompetent），导入细胞后不会发生复制。此外，长期传代后，病毒经过随时间推移的变性、稀释效应等，残留病毒被认为可忽略。

以上是关于细胞自身的生物扩散防范等级相关内容。

[向动物移植时]

当Luc导入发光细胞移植至动物的实验为“动物制备实验”，移植动物为“转基因生物”，受《卡塔赫纳生物安全议定书》的制约。该情况下的封闭等级需结合实验内容咨询贵机构的DNA重组实验委员会。

培养基使用建议

请参考细胞系数据页或产品特性页细胞基本信息表格中的培养基。

【选择要点】

通常，每款经典培养基都只有一个标准配方，但厂家也会提供许多改良产品，例如不含L-谷氨酰胺、含HEPES等配方。

L-谷氨酰胺

L-谷氨酰胺是所有哺乳动物细胞培养的必需氨基酸之一，所有培养基最后都应含有L-谷氨酰胺。然而，部分市售培养基并不含该成分，因为其在水溶液中稳定性较差，不适合在液体培养基中长期储存。如果您的培养基中不含该氨基酸，需另行添加。部分培养基含有其稳定替代物，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（例如GlutaMAX™、glutagro™）。

HEPES

通常而言，HEPES并非MEM、DMEM，RPMI 1640和Ham's  F-12等经典培养基的标准成分。HEPES有时被用于强效pH缓冲，但并非必需成分。

酚红

酚红是pH指示剂，通常包含在培养基中。

Eagle最低必需培养基（MEM）

- Earle's盐和Hank's盐：

如需在CO₂培养箱中培养，请选择Earle's盐配方。

-非必需氨基酸(NEAA)，丙酮酸钠：

NEAA和丙酮酸钠不是MEM的标准成分。

杜氏改良Eagle's培养基（D-MEM）

-低糖型与高糖型，丙酮酸钠：

标准配方为低糖型（1 g/L），高糖型（4.5 g/L）为改良版。除特别说明外，JCRB通常使用低糖型配方。丙酮酸钠是DMEM的标准成分之一。

抗生素

细胞培养中可使用抗生素，例如100 units/mL青霉素+100 ug/mL链霉素。不建议添加Fungizone（两性霉素B），它会抑制某些细胞类型的生长。

FBS（胎牛血清）和FCS（胎牛血清）

FBS和FCS是同一物质。

相关培养基产品

JCRB细胞库基本上使用标准配方的培养基。下表列举了采用标准配方的液体培养基产品。

细胞系首次培养指南

收到细胞后

细胞系到货后，请迅速将细胞从包装中转移至存储场所或进行培养。

冷冻细胞在-65℃以上会快速受损。

运输冻存管时，应使用干冰或少量液氮进行冷却。切勿使用冰（0℃）冷却冻存管，因为这样反而会升高其温度，导致细胞存活率降低。

首次培养指南

培养基和设备

○ 为避免过度稀释，请使用25 cm² 的培养瓶或6 cm的培养皿（或数据表中指定的更小的容器尺寸）

○ 根据产品详情页中的细胞基本信息准备合适的培养基。

应快速复苏细胞

【请逐支操作，切勿同时解冻两支或以上的安瓿瓶。】 1. 从包装中取出一支安瓿瓶。（请佩戴安全手套与防护面罩） 2. 立即将安瓿瓶放入温水中（＜ 37℃），摇晃并在2 分钟内解冻内容物。

接种至 25 cm² 培养瓶或 6 cm 培养皿

    如果数据表中特别推荐了培养基的用量，请按照说明进行操作。

9. 在25 cm²培养瓶或6 cm培养皿中组织培养。

    随附数据表中的细胞密度为对数生长期的标准密度，并非复苏时的实际密度。

10. 进行传代前，请确认细胞已恢复增殖。可能需要数天乃至一周的时间才能增殖。待细胞生长良好后，尽早制备冻存株。

Q&A

◆操作方法

Q. 收到细胞后，首先应该做什么？

A. 确认安瓿瓶是否破损，然后在液氮罐等容器中储存。

尽管细胞在运输中已格外注意，但运输过程中仍可能发生破损。请检查以下几点：

1. 运输容器是否破损？

2. 干冰是否维持了足够低温的环境？

3. 装有细胞的容器是否破损？

4. 收到的细胞是否与订单内容一致？

若不立即培养，请将细胞在液氮罐等容器中储存。

Q. 如何开启玻璃安瓿瓶？

A. 细胞储存于安瓿瓶中，请注意并按照以下方法开启。

注意1

本细胞库使用玻璃安瓿瓶储存细胞。因此从液氮罐中取出时可能会发生爆炸，请万分小心！！！从液氮（液相）中取出时必须穿长袖实验服，戴厚手套，着防护面罩，不要暴露手臂和脸等皮肤部位。

注意2
因使用硬质玻璃，需大力开封，易导致手指割伤，请小心。

· 开启方法(需准备物品：灭菌纱布、消毒用酒精、2 mL移液管)

1. 在离心管中准备约10 mL培养基。

2. 在37度左右的温水中融解安瓿瓶，用消毒用酒精充分擦拭安瓿瓶的颈部。

3. 用灭菌纱布包裹安瓿瓶瓶身。

4. 隔着纱布握住安瓿瓶瓶身，拇指用力按压安瓿瓶头部，将其颈部折断。

5. 缓慢打开纱布，取出安瓿瓶，使用2 mL移液器等采集细胞悬液，转移至1）中准备好的离心管中，1000-1200 rpm条件下离心3-5分钟沉淀

    细胞。

6. 离心后去除上清液，在新鲜的培养基中重悬沉淀（离心1次）

7. 细胞计数和细胞活力检测后，开始培养。

Q.细胞不增殖

A.可能是由于培养基、培养环境、细胞等存在问题。

（关于细胞质量（特别是增殖能力）的投诉等，仅限发货后3个月内受理）

Ⅰ 培养基

初始培养时请务必使用细胞信息表中指定的培养基。若使用指定以外的培养基，则无法提供保证。首先使用指定的培养基，确认细胞增殖状况，如必要，之后可以尝试使用自己的培养基。

1. 培养基是否放置过久？冷藏条件下，液体培养基建议3个月内使用、粉末培养基建议12个月内使用。

2. 保存状况是否不佳？是否存在反复加热、或是保存温度不当等情况导致培养基发生变质？

3. 是否按要求添加了血清和生长因子？血清的批次差异、厂家差异会对细胞增殖产生显著影响。而血清以外的增殖因子，可能因浓度不当或操作不

    当致其失活。

4. 增殖培养基的pH值是否合适？使用粉末配制培养基时，有些需要调整pH值。

5. 是否按要求添加补充剂？使用粉末培养基制备时，有时需要用户添加碳酸氢钠、HEPES 等成分。尤其对于高温高压灭菌的培养基，使用前

    必须添加已单独灭菌的碳酸氢钠及 L - 谷氨酰胺。 

Ⅱ 培养环境

建议一年校准一次CO2孵育箱，并定期清洁维护。

1. 温度是否合适？

2. 湿度是否合适？孵育箱内的加湿水槽中水量是否充足？

3. CO₂浓度是否合适？气瓶是否已耗尽？

Ⅲ 细胞

如果复苏和培养操作不当，后续细胞培养将非常困难。

1. 细胞密度是否合适？细胞密度低会导致细胞增殖开始时间延迟。

2. 细胞活力是否偏低？就悬浮细胞而言，由于活细胞与死细胞难以分离，所以培养开始前必须进行确认。

3. 是否确认细胞的分裂速度？不同细胞分裂所需的时间不同。快的细胞约12小时，慢的细胞则需2~3 天分裂一次。一般来说，癌来源细

    胞和血液细胞最快可在 24 小时内分裂，正常细胞相对较慢，通常需要 24 小时以上。

4. 是否出现了分化和老化？分化和老化会导致细胞停止增殖，请严格遵守培养条件。

5. 更换培养基的频率是否合适？更换培养基的时机因细胞密度而异，低密度的情况下请适当延长更换时间。

6. 是否在合适的时期进行传代培养？对于贴壁细胞，当其达到汇合状态后，部分细胞可能出现细胞死亡和分化等性状改变。而悬浮细胞达到最大

    细胞密度后，许多细胞会出现活力急剧下降的情况。

Q. 安瓿瓶上信息的含义？

A. 细胞编号，细胞名，传代次数等信息。

Q. 细胞应如何储存？

A. 请在液氮罐等容器内储存。（请勿在－80℃下长期储存）

一般认为细胞在液氮中可半永久储存。如果冻存细胞的存活率低，很可能是在冻存期间或取用其他细胞时，因某种原因导致温度上升。在－80℃超低温冰箱中，细胞可保存半年至一年左右，但存活率会随时间慢慢下降。

Q. 血清如何灭活？ （什么是血清灭活？）

A. 灭活血清中的补体成分，需在56℃条件下加热处理30分钟。

血清中的补体成分活化，可能会导致细胞受损，因此需将血清在56℃下加热30分钟使补体成分失活。

◆培养基、试剂

Q. 如何选择细胞培养用的培养基？（可以使用和细胞信息不同的培养基吗？）

A. 原则上请使用细胞信息中记载的培养基。

关于论文等中记载的培养条件，本细胞库尚未完全确认，因此无法解答。关于培养基与培养基添加剂，原则上没有指定厂家，请根据需求准备所需试剂并制备培养基。

Q. 培养基中是否需要添加抗生素？

A. 本细胞库常规培养细胞培养时，原则上不添加抗生素进行培养。

本细胞库的细胞由熟练的技术人员在洁净的环境中培养，细菌等污染混入的可能性非常低，通常不添加抗生素进行培养。这有助于避免对细胞造成非预期的影响，并防止耐药菌的出现。

◆质量管理

Q. 细胞被支原体污染了怎么办？

A. 建议重新购买可购买（获取）的细胞。

一旦确认细胞被支原体污染，基于以下原因，建议重新购买可购买（获取）的细胞。

1. 无法明确支原体污染的时间点。

2. 清除支原体污染需要大量时间。

3. 即便成功清除污染，细胞的性状也有可能发生改变。

JCRB细胞库出售的细胞，经检测均无支原体污染，可以放心使用。

◆生物安全

Q. 请告知处理细胞时需要的生物安全等级（BSL）。

A. 请在BSL-2下处理所有人源细胞。

JCRB细胞库会对人源细胞进行病毒检测，但因检测的局限性以及未知病毒存在的可能，所以请在BSL-2条件下处理细胞。此外，其他动物物种中，一些病毒生产细胞也需在BSL-2条件下处理。

◆关于发货

Q. 请详细介绍JCRB细胞库在运输细胞时采用的运输方法。

在日本运输细胞的示例程序（包装和干冰）。

冻存管放在填满干冰的泡沫箱中发货。夏季（6-9月）采用冷链运输，其他时间（10-5月）不特别指定冷链配送。

具体来说，对于一般的细胞株采用以下方法。

细胞冻存管包装

如下方照片所示，在塑料管的上下填充脱脂棉，将细胞冻存管放置在中间。

如果数量较多，则使用纸盒。

● 放入冻存管前，需要用液氮冷却已填充脱脂棉的外装塑料管。

● 如果液氮进入内部，取出时会气化并急剧膨胀，导致试管破裂。因此，冷却时务必要盖紧盖子。（或置于液氮罐中气体冷却）。

干冰

上述规格的泡沫箱中，约放入7 kg干冰。

1. 首先，用干冰板完全覆盖箱底和侧面。

2. 填充干冰至刚好能放入塑料管或盒子的空间。

3. 如果有缝隙，就将干冰敲碎后尽可能填满。

4. 顶部放干冰，像盖子一样盖住。

5. 尽可能上下左右全部填满干冰。

此外，上述是JCRB细胞库的发货示例，用户自行寄送冻存细胞时，使用试剂供应商处获得的、尺寸合适的泡沫箱即可，外箱非必需。

如果填充10 kg左右干冰，基本可以维持1天，可以根据包装进行尝试。

◆其他

Q. 购买的细胞能否转让给他人？

A. 原则上禁止转让给第三方。

在细胞出售时，购买申请人必须签署 “Request and Agreement Form (Form A)”，其中明确记载了禁止向第三方转让细胞的相关内容。这是为了保护细胞建立者的知识产权，也是为了保证本细胞库提供的细胞的品质，因此还请您理解并配合。如果您对此有疑问，可随时联系我们。