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Fluorospark® 激酶/ADP 多重-检测试剂盒
Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit

激酶分析筛选试剂盒021591068538.png

Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit


Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit 是富士胶片和光与日本东京大学新药研究机构共同研发的 ADP 荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选(HTS)所必须的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶,同时可用于检测产生 ADP 的酶(如 ATP 酶、乙酰基— CoA 羧化酶)的活性。



◆原


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本试剂盒通过酶偶联反应简单、高灵敏度的定量检测 ADP 。通过激酶反应产生的 ADP 用红色荧光物质试卤灵定量。



优点、特色


●   适合终点(endpoint)和实时实验

●   优异的 Z'-factor 数据(数据差异小)

●   高灵敏度检测 ADP 量

●   检测直到 ADP 30 μmol/L 仍可保持线性关系

●   一步反应,检测时间短(~30分钟)

●   成本较低



与传统方法(发光)比较


试剂名称

Fluorospark® Kinase

传统发光法(公司)

原理

ADP 定量(荧光)
  (直接定量生成的 ADP)

ADP 定量(发光)
  (需要把生成的 ADP 变换成 ATP 再定量)

操作顺序

1步

2步

所需时间

30 分钟

70~100 分钟

ADP 定量范围

~30 μmol/L

~1 mmol/L

价格

低成本

高成本

优点

Z'-factor 数值高
  适合实时、终点反应

动态范围大
  S/B 比高

 


试剂盒组成


No. 试剂

用途

1,000

底物液

2×制备检测液

9 mL

酶液

500 μL

刃天青液

100 μL

还原封闭剂

400 μL

D 终止液

停止偶联反应

10 mL

10 mmol/L ATP 溶液

激酶反应,制作标准曲线

100 μL

10 mmol/L ADP 溶液

制作标准曲线

100 μL



案例、应用


【实验流程(终点(endpoint)法)】


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  激酶反应液里添加等量的2×检测液(使用时制备)即可检测激酶活性



【制作 ADP 标准曲线】


用 0、10、20、30 μmol/L ADP 制作标准曲线。


  

良好的线性关系可定量最多至 30 μmol/L 的 ADP。



【低浓度 ADP 区域里定量】


制作各 ATP/ADP 浓度(ATP+ADP=1,10,100 μmol/L)里底物变换率 0-10% 标准曲线


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ATP/ADP标准曲线里底物变换率低(=ADP浓度低)时线性关系依然较好

 


【荧光信号的稳定性】


20 μmol/L ADP 和 2x检测液混合,在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%,相关变动表格如下。



  ADP和2×检测液混合后,在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。



【数据:Z'-factor 实测值】


定量与各 ATP/ADP 浓度(ATP+ADP=1,10,100 μmol/L),5%底物变换率相当的 ADP 时,本试剂盒方法与传统发光法的 Z'-factor 比较。




  Z'-factor:Fluorospark® Kinase >传统发光法(A公司)

  在各ATP浓度里,5%低底物变换率也有优异的 Z'-factor。



什么是 Z'-facotr
  

Z'-facotr 是一个关于信号区间和变异的组合,它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用 Z'-factor = 1 - (3×SDH + 3×SDL)/(AvH-AvL) 公式计算(SDH 和 SDL 为阳性对照和阴性对照的方差,AVH 和 AVL 为阳性对照和阴性对照的平均值)。


 Z-factor

 Interpretation

 1.0

 理想情况下等于 1.0。Z factor 永远不可能超过 1.0。

 0.5 - 1.0之间

 较好的实验。

 0 - 0.5 之间

 临界的实验(较差的实验)。

 小于0

 阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。



【制作抑制曲线】

  

制作 cAMP- 依赖性蛋白激酶(PKA)抑制剂 H-89 的抑制曲线

  (PKA 0.02 U/μL,ATP 5 μmol/L,Kemptide 125 μg/mL 及各浓度的 H-89)


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  Fluorospark® Kinase 与传统发光法(A公司)有几乎相同的 IC50 值。

  (本方法得到的 H-89 IC50值与文献值*(IC50=40nmol/L)几乎相同)

  * Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).



【实验流程(实时法)】


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通过实时检测荧光强度,实时检测激酶活性。



【ADP 定量反应时间的比较(实时检测)】

  

对各浓度 ADP[ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2 μmol/L(ATP+ADP=10 μmol/L)]进行实时检测。


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  Fluorospark® Kinase 在约十分钟内完成 ADP 定量反应。背景(ADP=0 μmol/L)信号稳定。



【实时检测添加 DTT 的影响】

  

ADP=2 μmol/L(ATP+ADP=10 μmol/L)里添加还原剂 DTT(0.1、1 mmol/L),进行实时检测。



  Fluorospark® Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高,结果依然稳定。



【通过实时检测计算 PKA 的 Km(ATP)值】

  

在各种 ATP 浓度下通过实时检测计算出 PKA 反应速度,并求取 ATP 的 PKA(Km 值)。

  PKa 0.02 U,各浓度的 ATP 及 Kemptide 100 μg/mL


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  根据实时检测进行酶的动力学分析。

  (本方法得到的 Km 值与文献值**(3~15 μmol/L)几乎相同)

  ** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).



Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit 参考资料>
1) Kumagai, K. et al.: Anal. Biochem., 447, 146-155 (2014).
2) 东京大学新药研究机构网址 
http://www.ddi.u-tokyo.ac.jp/


产品列表
产品编号 产品名称 产品规格 产品等级 备注
291-77401 Fluorospark® Kinase/ADP Multi-Assay Kit
 Fluorospark®激酶/ADP 多重-检测试剂盒
1000次

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