粘蛋白检测试剂盒
Mucin Assay Kit
——健康和美容研究试剂
◆背景
粘蛋白属于高度糖基化蛋白质家族，是粘膜的主要成分，例如唾液，泪液，胃液，肠液。粘蛋白的 基本构型是枝状糖链连接到多肽的大分子。糖链的非均质特性使其具有多样性，分子具有各种功能，如特异性分子识别。 粪便粘蛋白测定可用作肠屏障功能的指标。该试剂盒利用荧光检测来测定粘蛋白的含量。 我们提供的该试剂盒可以供研究功能性食物和感染的客户使用。 |  |
步骤１：从粪便中提取和部分纯化粘蛋白。
步骤２：粘蛋白Ｏ-糖苷连接的寡糖链的测定通过稀碱进行β-消除，形成糖链的还原端。还原碳水化合物在高温下进行荧光标记以产生荧光缩合
物。
粘蛋白的结构
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◆试剂盒组分
组件 | 规格 | 数量 | 储存条件 |
缓冲溶液Ａ | 100 mL | 3 | 4-10℃ |
缓冲溶液Ｂ | 25 mL | 1 | |
缓冲溶液Ｃ | 25 mL | 1 | |
试剂Ａ | 1.0 mL | 1 | |
试剂Ｂ | 1.5 mL | 2 | |
标准溶液 （GalNA，250 μg/mL） | 1.0 mL | 1 | |
酶溶液 | 1.5 mL | 1 |
◆优点・特色
● 粘蛋白和 IgA 能阻止细菌和毒素的入侵
● 作为肠屏障的一部分，粘蛋白和 IgA 能防止病原菌和毒素通过肠壁转移到血管内。
测定理论
通过对粪便中的 β-葡萄糖苷酶热变性防止粪便粘蛋白降解
↓
粗提取粘蛋白
↓
用酶溶液分解淀粉
↓
用乙醇沉淀纯化粘蛋白
↓
将试剂Ａ加入纯化的粘蛋白中，并在碱性条件下进行热处理。 （试剂Ａ将与粘蛋白的糖还原末端反应，并在碱处理后发出荧光）
↓
加入缓冲液Ｃ并测定荧光强度（激发336nm，荧光383nm）
（具体操作请看相关资料）
◆案例・应用
喂食高脂肪食物的大鼠肠屏障部分注射多酚的效果
图1 粘蛋白定量标准曲线 |
图2 粪便中的粘蛋白含量 |
应用
用于测定粪便中的粘蛋白含量。
相关资料
● 本产品是专为荧光酶标仪测量设计（96孔板）。
● 当使用荧光读板机时，可测量100个样品。
● 当使用分光光度计测量时，请使用微细胞。
缓冲液Ａ的制备
用100 mL蒸馏水溶解1块片剂。
粪便粉末的制备：粪便冻干并在研钵中研磨，储存在-20℃备用。
II.粪便粘蛋白的测定
1、称量100 mg粪便粉末放入微量试管（2 mL）中，加入1 mL缓冲液A，然后用涡流混合器混合30秒钟。
2、在95℃下加热试管10分钟使细菌的糖苷酶变性。
3、在37℃下加热90分钟，从粪便中提取粘蛋白。
4、在4℃下离心20,000×g 15分钟。
5、将200 μL上清液转移到另一个微量试管中，加入200 μL缓冲液B，用涡流混合器混合溶液。
6、加入10 μL酶溶液混合，在50℃下加热试管20分钟分解淀粉。
7、将离心管冷却至室温，加入125 μL的99.5％乙醇，混合后，在-20℃下静置过夜。
8、次日，在4℃下20,000×g离心10分钟，去上清。向沉淀加入1mL缓冲液A，重溶沉淀。（样品溶液）
9、将20 μL样品溶液和标准溶液转移到另一个微量试管（500 μL）中，加入24 μL试剂混合物（使用前以1:5混合试剂A和试剂B），混合后， 100℃下加热微量试管30分钟。
10、冷却至室温，加入200 μL缓冲液C，用涡流混合器混合。
11、将100 μL溶液转移到96孔黑色孔板中，并在波长（例如：336 nm em：383 nm）实用荧光读板机测量荧光强度。
12、通过如下所示的连续稀释创建标准曲线。 通过这些点绘制平滑曲线以构建标准曲线。 通过标准曲线读取样品的浓度。
13、计算1 g粪便中的粘蛋白含量。步骤（12）测得的值的50倍是1g粪中的粘蛋白含量。
Calibrator Number | Quantaity of Standard | Quantaity of Dilution Buffer | Final Concentration |
1 | 500 μL of Standard Solution | 0 | 250 μg/mL |
2 | 500 μL of Calibrator 1 | 500 μL | 125 μg/mL |
3 | 500 μL of Calibrator 2 | 500 μL | 63 μg/mL |
4 | 500 μL of Calibrator 3 | 500 μL | 31.5 μg/mL |
5 | 500 μL of Calibrator 4 | 500 μL | 15.75 μg/mL |
6 | 500 μL of Calibrator 5 | 500 μL | 7.875 μg/mL |
7 | 0 | 500 μL | 0 |
工作校准品：N-乙酰葡萄糖胺250 μg/ mL
● 通过连续稀释创建标准曲线，如下图所示。
● 剩余的未稀释校准品应储存在2-10°C。
● 稀释校准品稳定，可在2-10°C保存1个月。
参考文献
［1］ | Susumu Honda,Yoshikazu Matsuda, Masaye Takahashi, and Kazuaki KakehiFluorimetric Determination of Reducing Carbohydrates with2-Cyanoacetamide and Application to Automated Analysis of Carbohydrates as Borate Complexes.(1980) Analytical Chemistry, Vol.52, No. 7 |
［2］ | Bovee-OudenhovenIM, Termont DS, Heidt PJ, et al.: Increasing the intestinal resistance of rats to the invasive pathogen Salmonella enteritidis: additive effects of dietary lactulose and calcium. Gut 40: 497-504, 1997. |
［3］ | Crowther RS, Wetmore RF: Fluorometric assay of O-linked glycoproteins by reaction with 2-cyanoacetamide. Anal Biochem 163: 170-174, 1987. |
［4］ | Okazaki Y, Han Y, Kayahara M, Watanabe T, Arishige H, Kato N. Consumption of curcumin elevates fecal immunoglobulin A, an index of intestinal immune function, in rats fed a high-fat diet. J NutrSciVitaminol (2010);56(1):68-71. |
［5］ | YukakoOkazaki,HiroyukiTomotake, Kazuhisa Tsujimoto, Masahiro Sasaki,andNorihisa Kato. Consumption of a Resistant Protein, Sericin, Elevates Fecal Immunoglobulin A, Mucins, and Cecal Organic Acids in Rats Fed a High-Fat Diet. (2011) The Journal of Nutrition, 21, 10.3945/jn.111.144246. |
［6］ | ZakiUtama,Yukako Okazaki, Hiroyuki Tomotake, Norihisa Kato, Tempe Consumption Modulates Fecal Secondary Bile Acids, Mucins, Immunoglobulin A, Enzyme Activities, and CecalMicroflora and Organic Acids in Rats. Foods Hum Nutr(2013) 68:177-183 |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| CSR-FFA-Mu-K01E | Mucin Assay Kit 粘蛋白检测试剂盒 |
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