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适用于灵长类 ES/iPS 细胞的玻璃化冻存液
StemCell Keep

产品特性
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Q&A
参考文献

适用于灵长类 ES/iPS 细胞的玻璃化冻存液

StemCell Keep

StemCell Keep 在保持高玻璃化能的同时，抑制了细胞毒性，是一款适用于灵长类 ES/iPS 细胞的玻璃化冻存液。

※本产品仅供研究使用，研究以外不可使用

◆关于 DAP213 等含有 DMSO 的保存液的问题

DMSO 作为普通细胞冷冻保护成分常被添加到保存液中，但同时也是对人体有害的成分，且极易被皮肤吸收。除具有细胞毒性外，如同下列论文所述，是影响细胞分化的因子之一。因此， DMSO 用于保存并不是十分理想的。现有的玻璃化冻存液 DAP213 中除了高浓度DMSO之外，还被指出含致癌性物质乙酰胺。除此之外，由于其溶质浓度高，还被指出会因为渗透压引起毒性。

另外，使用 DAP213 时，若不能在 10~30 s 内完成保存，那么解冻后的存活率便会大幅下降，而 StemCell Keep 只需在是在约 1 min 内完成保存，且操作难度低，也不需要娴熟的技术。

参考文献

・使用 DMSO 将人骨髓白血病细胞株 HL-60 分化为粒细胞。

Jiang, G., et al., Int. Immunopharmacol., 6 (7), 1204～1213 (2006).

・使用DMSO将小鼠间充质干细胞分化为心肌细胞。

Young, D. A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 322 (3), 759～765 (2004).

・使用含有 DMSD 的保存液冻存人ES细胞发现未分化标记 Oct-4 的表达降低。

Katkov, I. I., et al., Cyobiology, 53 (2), 194～205 (2006).

◆玻璃化冻存法是什么

玻璃化冻存法是一种将细胞直接迅速浸没到液氮中防止水结晶，并在非晶质的玻璃状态下进行冷冻的方法。该方法的优点在于水的体积不会膨胀，因此给细胞带来的损害较少。若采用一般冷冻法，灵长类ES/iPS细胞在解冻后的存活率较低，所以我们推荐使用玻璃化冻存法。然而，由于玻璃化需要较高的溶质浓度，存在细胞毒性容易因溶质变高的问题，因此低毒性冻存液的诞生备受期待。

◆关于灵长类ES/iPS细胞保存和玻璃化冻存法

灵长类ES/iPS细胞经不起冷冻
	● 使用一般的10%DMSO保存液缓慢冷冻（置于-80°C）时存活率较低 ● 细胞集落冻存后存活率仅为0.1~1%
建议使用玻璃化冻存法进行保存
	● 直接浸没于液氮中防止水结晶化，在非晶质的玻璃状态下冷冻的方法 ● 将细胞悬浮于玻璃化溶液中，然后立即将整个冻存管浸没到液氮中，使● 其玻璃化 ● 该方法的优点在于水的体积不会膨胀，因此给细胞带来的损害较少
传统玻璃化冻存法的问题
	● 玻璃化需要较高的溶质浓度，容易因溶质提高毒性（渗透压） ● 为防止水重结晶，必须迅速解冻 ● 需要娴熟的技术
现有玻璃化冻存法的问题
	● 为小鼠受精卵玻璃化用而开发，以少量溶液（数μL）即可玻璃化为前● 提。若用于ES/iPS细胞而增加溶液量（约200 μL的话），则会导致玻● 璃化状态不稳定，容易重结晶 ● 现有的玻璃化冻存液所含的乙酰胺具有致癌性，DMSO还会影响分化● （Oct4表达降低），因此不受欢迎
优化玻璃化溶液开发StemCell Keep

◆特点

● 不含影响分化的DMSO以及动物蛋白成分

● 通过玻璃化法保存可在保持细胞集落状态下进行冻存

● 可在维持干细胞多向分化能的状态下进行（未分化状态）冻存

● 在高安全性新型冷冻保护物质（专利申请中）的高度细胞保护作用以及玻璃状态维持作用下，能够更高效地冻存● ES/iPS细胞细胞集落

● 按照使用方案使用的情况下，可保存100管

● 经无菌测试确认无细菌、真菌、支原体污染

● 本产品可在4°C下长期稳定保存（有效期2年）

※使用台盼蓝处理StemCell Keep保存的细胞时，请务必清洗细胞。

◆案例比较

人iPS细胞冻存

使用现有玻璃化冷冻液（DAP213）以及本产品冻存人iPS细胞一周，图为解冻第二天的细胞集落形成率以及4天后的细胞数量（复苏率）与非冷冻组形成的百分比。结果表明，使用本产品冷冻的组的保护效果明显更好。

◆应用实例1

解冻使用本产品冷冻的人iPS细胞后的未分化标记表达

无论是（A）碱性磷酸酶（AP）、（B）OCT-4、（C）SSEA-4、（D）TRA-1-60都呈阳性，由此可知细胞维持了未分化状态。

解冻使用本产品冷冻的人iPS细胞后的多能性评估

将解冻后的iPS细胞在未经处理的板上培养，制备胚状体后，在普通的培养板上培养一周。检测出了三胚层来源的蛋白。

◆应用实例2

使用本产品保存京都大学来源的人ES细胞（KhES1, KhES3）后进行培养，分析其各种生物标记物和表型。

无论是在SNL饲养细胞上（A、B）还是在涂布了Matrigel的板上（C、D）进行培养，ES细胞都有成长。

培养5日后，确认到AP（碱性磷酸酶）的表达。

将hES1细胞播种至SNL饲养细胞中分别培养3、4、5、6天后进行AP染色，测量细胞集落数。使用本产品保存的细胞第3天起形成细胞集落，直至第6天细胞集落逐渐变大。使用DAP213保存的细胞在第2天仍然很少，虽然第3天的细胞集落数与使用本产品保存的细胞的细胞集落数相同，但本产品的细胞集落更大。

将使用本产品冷冻的ES细胞解冻后，通过流式细胞术分析干细胞标记TRA-1-60的表达。

使用本产品保存的细胞与DAP213的Nanog表达水平几乎相同。

图中紫色部分为Nanog阳性细胞，绿色部分为对照细胞。

本产品保存量的97.6%，DAP213保存量的96.2%为阳性。

确认了使用本产品保存的细胞的细胞核类型（染色体类型）是否有变化。

通过RT-PCR分析各mRNA表达量时采用⊿⊿Ct法。结果显示，当SOX2设置为1时，除了Nanog以外，本产品与DAP213在显示hEs细胞的未分化能的转录因子和粘附因子的表达率相同。

◆应用实例3

人iPS细胞冻融过程中StemCell Keep和DAP213的对比研究（数据提供：山梨大学）

冷冻人iPS细胞时，建议使用DAP213的简易玻璃化法。

但是这个方法有着以下的问题：

● DAP213中含有的DMSO会抑制Oct3/4的表达。

● 乙酰胺具有致癌性

● DAP213可作为冷冻胚时的少量冷冻剂使用，但不适用于大容量的细胞保存。

● 添加DAP213后必须在15 s内浸没到液氮中，需要娴熟的技术。

关于人iPS细胞（201B7株，理研BRC）1，在添加StemCell Keep以及DAP213后，分别在15、45、90 s后浸没到液氮中，并保存6天。解冻后，再培养6天，在此期间测量细胞的细胞集落密度、细胞集落大小、细胞集落面积率。

细胞集落密度

使用StemCell Keep冷冻的hiPS细胞的细胞集落密度与添加DAP213 15 s后进行冷冻处理的结果相同。使用DAP213冷冻的hiPS细胞的细胞集落形成明显受浸没前的时间长短影响，但使用StemCell Keep的细胞在解冻后的细胞集落形成几乎不受影响（图1、2）。

细胞集落大小

图3、4为细胞集落大小。使用DAP213冷冻时的细胞集落比使用StemCell Keep冷冻时的细胞集落要小一些。高粘性的StemCell Keep抑制了移液时引起的水势，结果表明，StemCell Keep的细胞集落与DAP213相比更稳定。

细胞集落面积率

由于hiPS细胞的细胞集落为单层的均一结构，因此细胞集落面积大小可直接反映细胞数。使用StemCell Keep冷冻的hiPS细胞的细胞集落占有面积率与添加DAP213 15 s后进行冷冻处理的结果相同。（图5、6）。其中，即使在添加StemCell Keep45 s以及90 s后进行冷冻处理也几乎没有偏差，解冻后可稳定地恢复。

由于使用DAP213时，从添加到冷冻处理之间的时限很短，因此需要操作者娴熟的技术。但是，使用StemCell Keep的话这些问题都能迎刃而解。因此，本次对比研究中，45 s的冷冻确保了充足的时间，并且证实了hiPS细胞解冻后可以充分恢复。另外，即使操作花费了90 s，稳定性虽然会下降但也可以充分恢复，可以尽可能地回避操作过程中发生始料不及的事故的风险。

但StemCell Keep也有着试剂粘性过高，难以提取以及混合等问题。在混合时，可以多花些时间，务必仔细彻底地混合5次左右。

※使用DAP213时，hiPS细胞的存活率约为20%。

参考文献

1. Takahashi, K., et al., Cell, 131 (5), 861～872 (2007).