深层组织的高分辨率·高亮度分析
SeeDB2
SeeDB2是由柯孟岑、今井猛博士等人开发的一种新型组织透明化试剂。特别适用于通过荧光蛋白标记样本的3D高分辨率成像。
对照SeeDB2G的甘油折射率（1.46）和SeeDB2S的油折射率（1.52），分别用甘油浸没镜头和油浸镜头观察，可见即使在深层部分也没有因为球面像差而引起模糊（分辨率降低）。
此外值得注意的是在SeeDB2中，荧光蛋白的荧光保持非常稳定，并且优于PBS和其他市售的封固剂。因此，SeeDB2十分适合作为荧光蛋白标记样本的封固剂。它不仅可用于厚样本，还可用于细胞生物学的薄样本和组织切片。
本试剂盒内容：1) 皂素、2) SeeDB2G solution、3) SeeDB2S solution、4) PBS
SeeDB2是通过调整Permeabilization solution、Clearing Solution等各种试剂，可实现透明化的试剂盒。
数据提供：国立研究開発法人理化学研究所柯孟岑先生、今井猛先生（现九州大学医学研究院）
◆SeeDB2组织透明化实验案例（小鼠脑切片厚度0.5-2 mm）
*在组织透明化实验中需要注意根据样本量调整试剂量和处理时间。
图1. 小鼠脑SeeDB透明化案例
小鼠脑切片（1.5mm厚）的SeeDB2处理前后
图2. 用共聚焦显微镜观察Thy1-YFP H系小鼠脑切片
组织透明化试剂Q&A ver1.0
Tissue clearing reagent Q&A ver1.0
Q：组织透明化的原则
Ａ：组织透明化通常是按下面的步骤进行的：
Ａ：（a）固定 （b）透化 （c）脱色 （d）折射率匹配
Q：组织透明化的优势
Ａ：目前大多数可用的透明化技术，都是通过编码荧光报告蛋白或者用荧光标记抗体进行后标记，从而可视化组织中特定的蛋白。组织透明化成为了
Ａ：具有单细胞分辨率的组织3D成像中重要的一环。
Q：透明化技术的比较
Ａ：下面是水性的透明化技术。
SeeDB（基于果糖的方法）在一些应用中有一定优势。因为SeeDB不含去垢剂，所以对于透明化DiI(细胞膜红色荧光探针，一种神经示踪剂)标记的样品和使用光电关联显微镜（CLEM）的情况下，SeeDB有着一定优势。另外SeeDB会产生自体荧光，有时候会对辨认未标记的神经元结构（如神经毡）起着一定帮助。SeeDB2是为使用高NA物镜的高分辨率成像而优化的技术；因此，当处理较大的组织时，CLARITY或者CUBIC会是更好的选择。
Q：切片厚度的最大值和最小值？
Ａ：您应该根据您的物镜的WD（工作距离）来决定切片的厚度。我们建议切片的厚度不要超过3mm。对于十分薄且脆弱的样品，我们建议使用琼
Ａ：脂糖包埋。使用CUBIC，可以让全器官、全身透明化和使用LSFM的快速3D成像具有可重复性。
Q：试剂盒成分
Ａ：具体如下：
Ａ：1. SCALEVIEW-S试剂盒（299-79001）适用于20份1-2mm的切片样品
Ａ：Ａ：1） SCALEVIEW-S0——100mL
Ａ：Ａ：2） SCALEVIEW-S1——100mL
Ａ：Ａ：3） SCALEVIEW-S2——100mL
Ａ：Ａ：4） SCALEVIEW-S3——100mL
Ａ：Ａ：5） SCALEVIEW-S4——100mL
Ａ：Ａ：6） SCALEVIEW-SMT——100mL
Ａ：2. SCALEVIEW-S试剂盒（290-80801）适用于20-30份1-2mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） SCaleCUBIC-1 Solution——250mL
Ａ：Ａ：2） SCaleCUBIC-2 Solution——250mL
Ａ：Ａ：3） Mounting Solution 1——40mL
Ａ：Ａ：4） Mounting Solution 2——40mL
Ａ：3. SeeDB试剂盒（299-79901）适用于20-30份1-2mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） SeeDB：20w/v% Fructose Solution——50mL
Ａ：Ａ：2） SeeDB：40w/v% Fructose Solution——50mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB：60w/v% Fructose Solution——50mL
Ａ：Ａ：4） SeeDB：80w/v% Fructose Solution——50mL
Ａ：Ａ：5） SeeDB：100w/v% Fructose Solution——50mL
Ａ：Ａ：6） SeeDB——50mL
Ａ：4. SeeDB2试剂盒（294-80701）适用于20-30份1-2mm的切片样品。
Ａ：Ａ：1） Saponin（皂角苷）——5g
Ａ：Ａ：2） SeeDB2G solution——50mL
Ａ：Ａ：3） SeeDB2S solution——50mL
Ａ：Ａ：4） PBS——50mL
Q：样品的保存
Ａ：SCALEVIEW-S处理的样品应在室温下保存2至3周。您可以在2至3周内观察SCALEVIEW-S透明化的样品中的荧光信号。CUBIC处理的样品应在
Ａ：室温下保存1周。您可以在1周内观察CUBIC透明化的样品中的荧光信号。SeeDB2G处理的样品应在冰箱中保存1年，而SeeDB2S处理的样品则
Ａ：可在室温下保存1年。您可以在1年内观察SeeDB透明化的样品中的荧光信号。
Q：抗体的荧光标记
Ａ：应在进行透明化前就进行抗体的荧光标记。
Q：适用于SCALEVIEW-S的显微镜
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Q：适用于CUBIC的显微镜
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Zeiss Lightsheet Z.1（Carl Zeiss）
Q：适用于SeeDB2的显微镜
Ａ：Confocal（最好使用高NA的油浸镜头）
Ａ：STED（Leica Microsystems）
Ａ：SR-SIM（Carl Zeiss）
Ａ：SD-OSR（Olympus）
Ａ：FV-OSR（Olympus）
Ａ：Airyscan（Carl Zeiss）
Ａ：HyVolution（Leica Microsystems）
Ａ：Two-photon（最好使用复合浸没镜头）
Ａ：Confocal（最好使用高NA的甘油浸镜头）
Ａ：Light-sheet DLS（Leica，最好使用定制镜面的设备）
Q：重构
Ａ：对于定量用途，我们建议使用Neurolucida系统（MBF）。我们同样测试了VAST Lite用于成像用途时的表现。重构时也可以使用开源软件。
Ａ：例如，Vaa3d可以处理大量的拼接图像的数据。
Q：物镜推荐
Q：其他物种？其他器官？
Ａ：对于昆虫样品和鱼类样品，建议选择CUBIC。
Ａ：昆虫相关文献：Ohuma.et al.: Fish Pathology, 52(2), 96(2017).
Ａ：鱼类相关文献：Konno and S.Okazaki .: Zoological Letters, 4:13(2018).
对于多细胞球状体，选择SCALEVIEW-S会更好。
https://www.nature.com/articles/s41598-018-29169-0
参考文献
1.Ke et al.,: Cell Reports 14, 2718(2016)
2.SeeDB Resources (https://sites.google.com/site/seedbresources/): updated information and technical TIPs from the authors.
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 294-80701 | SeeDB2 Trial Kit | 1 kit | 组织透明化试剂 | - |
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