CTGF ELISA 试剂盒
结缔组织生长因子CTGF（Connective Tissue Growth Factor）是一种由脐静脉和血管内皮细胞产生的约38 kDa的分泌蛋白。除了参与细胞粘附和软骨细胞的增殖和分化以外，它也被认为是组织纤维化的一个主要因素，还可作为纤维化疾病的候选标志物。
FUJIFILM Wako可提供用于检测CTGF全长的ELISA试剂盒以及检测全长+N末端的ELISA试剂盒，通过组合使用这两种ELISA试剂盒，能够准确检测作为特发性肺纤维化（IPF）候选生物标志物的血液N末端CTGF片段。
◆什么是CTGF？
CTGF（ Connective Tissue Growth Factor）是一种由脐静脉和血管内皮细胞产生的约38kDa的分泌蛋白。它是CCN (Cyr61/CTGF /Nov)家族的一种，亦称为CCN2。CTGF主要由Module 1 - Module 4的四个部分组成，Module 1称为IGF结合结构域，Module 2称为VWC结构域，Module 3称为TSP-1结构域，Module 4称为CT结构域。各结构域通过与不同的因子结合来发挥作用。
CTGF在组织纤维化中发挥重要作用，因此可作为纤维化的候选生物标志物。CTGF由TGF-β诱导表达，通过促进产生细胞外基质的肌成纤维细胞的分化和胶原蛋白的合成，从而参与纤维化1）。在小鼠皮肤纤维化中，TGF-β和CTGF已被证明分别在纤维化的发生和持续中起重要作用2）。此外，还有报告称CTGF与软骨细胞的增殖和分化，细胞间的粘连有关。
CTGF除了全长CTGF之外，还有Module 2 － Module 3间被切断产生的N末端(Module 1-2)CTGF和C末端(Module 3-4)CTGF。由于CTGF（C末端）容易被分解，所以血液中主要以CTGF （全长）和CTGF (N末端)的形式存在。CTGF (N末端)作为特发性肺纤维化(IPF: Idiopathic Pulmonary Fibrosis)的生物标志物备受期待3)，但由于CTGF（全长)和CTGF（N末端）同时存在，所以单独检测CTGF（N末端）非常困难。
◆试剂盒组成
96次用 | |
抗体固相化孔板 | 1 plate |
CTGF标准品 | 1支 |
缓冲液 | 20 mL |
生物素结合抗体溶液 | 100 μL |
过氧化物酶结合链霉亲和素溶液 | 100 μL |
TMB溶液 | 12 mL |
反应终止液 | 12 mL |
清洗液（10×） | 100 mL |
标准品样品制备溶液 | 100 mL |
孔板封条 | 4片 |
◆CTGF ELISA试剂盒 Wako
FUJIFILM Wako可分别提供检测CTGF全长以及全长+N末端的ELISA试剂盒。通过组合使用两种ELISA试剂盒，可准确检测特发性肺纤维化(IPF)的生物标志物——血液中的N末端CTGF4)。
产品系列
产品名称 | CTGF（全长）ELISA试剂盒 Wako | CTGF（全长+N末端）ELISA试剂盒 Wako |
产品编号 | 290-84701 | 292-84901 |
检测对象 | CTGF（全长） | CTGF（全长+N末端） |
检测原理 |
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样品 | 人血清，人血浆(EDTA) | |
标准曲线范围 | 7.81-500 pM | |
所需样品量 | 人血清：5 μL，人血浆(EDTA)：10 μL | |
检测时间 | 2 h 50 min | |
检测法 | 显色法 | |
◆性能数据
■ 全长，N末端片段，C末端片段的交叉性
分别使用各ELISA试剂盒与全长，N末端片段，C末端片段反应，确认其交叉性。
【结果】
CTGF（全长）ELISA试剂盒 Wako可以特异性检测CTGF全长，CTGF（全长+N末端）ELISA试剂盒 Wako可以特异性检测CTGF全长和N末端片段。
■ 与CCN家族的交叉性
确认了包含CTGF在内的与CCN家族的交叉率（500 pM，n=8）。
CTGF ELISA（全长） 交叉率 (%) | CTGF ELISA（全长+N末端区域） 交叉率 (%) | |
CCN1 | <0.5 | N.D. |
CCN2（CTGF） | 100 | 100 |
CCN3 | <0.5 | N.D. |
CCN4 | <0.5 | N.D. |
CCN5 | <0.5 | N.D. |
CCN6 | <0.5 | N.D. |
N.D. = 未检出
【结果】
FUJIFIM Wako的试剂盒在CCN家族中，对CCN2(CTGF)显示高特异性。
■ 加标回收测试
CTGF(全长+N末端) ELISA试剂盒 Wako
样品ID | 添加量 (pM) | 检测值 (pM) | 回收量 (pM) | 回收率 (%) |
人血清 | 0 | 61.5 | ― | ― |
10 | 71.4 | 9.9 | 99 | |
50 | 110 | 48.5 | 97 | |
100 | 163 | 102 | 102 | |
150 | 215 | 154 | 103 | |
300 | 370 | 309 | 103 | |
平均 | 101 | |||
人血浆（EDTA） | 0 | 71.5 | ― | ― |
10 | 80.8 | 9.3 | 93 | |
50 | 121 | 49.5 | 99 | |
100 | 174 | 103 | 103 | |
150 | 227 | 156 | 104 | |
300 | 380 | 309 | 103 | |
平均 | 100 |
CTGF(全长) ELISA试剂盒 Wako
样品 | 添加量 (pM) | 检测值 (pM) | 回收量 (pM) | 回收率 (%) |
人血清 | 0 | 37.8 | ― | ― |
10 | 47 | 9.2 | 92 | |
50 | 87.4 | 49.6 | 99.2 | |
100 | 141 | 103 | 103 | |
150 | 191 | 153 | 102 | |
300 | 343 | 305 | 102 | |
平均 | 99.6 | |||
人血浆 (EDTA) | 0 | 16.9 | ― | ― |
10 | 26.2 | 9.3 | 93 | |
50 | 65.6 | 48.7 | 97.4 | |
100 | 122 | 105 | 105 | |
150 | 173 | 156 | 104 | |
300 | 326 | 309 | 103 | |
平均 | 100 |
■ 稀释线性测试
CTGF(全长+N末端) ELISA试剂盒 Wako
人血清 | 人血浆 |
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CTGF(全长) ELISA试剂盒 Wako
人血清 | 人血浆 |
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◆应用数据
■ N末端CTGF的检测（稀释线性测试）
使用梯度稀释的人血清或人血浆(EDTA)，用CTGF（全长+N末端）ELISA试剂盒 Wako检测CTGF全长+N末端， 用CTGF（全长）ELISA试剂盒 Wako检测CTGF全长。求差值计算CTGF（N末端）量，确认稀释线性。
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样品 | 稀释倍率 | CTGF（全长＋N末端）（pM） | CTGF（全长）（pM） | CTGF（N末端）(pM） |
人 血清 | 1/1 | 1735 | 952 | 783 |
1/2 | 875 | 495 | 380 | |
1/4 | 417 | 237 | 180 | |
人 血浆(EDTA) | 1/1 | 684 | 126 | 558 |
1/2 | 347 | 66.2 | 281 | |
1/4 | 157 | 34.9 * 参考值 | 122 |
【结果】
使用该方法检测定量CTGF（N末端），可观察到高稀释线性。
■ 健康者和IPF患者血浆中N末端CTGF的检测
使用CTGF（全长+N末端）ELISA试剂盒 Wako和CTGF（全长）ELISA试剂盒 Wako，检测从健康者以及特发
性肺纤维化（IPF）患者中提取的血浆（EDTA），并求出N末端CTGF的量。
健康者 | |||
ID | CTGF（全长+N末端）（pM） | CTGF（全长）（pM） | CTGF（N末端）（pM） |
1 | 494 | 83.4 | 411 |
2 | 535 | 116 | 419 |
3 | 580 | 155 | 425 |
4 | 661 | 129 | 532 |
5 | 383 | 63.5 | 319 |
mean | 421 | ||
SD | 75.6 | ||
IPF患者 | |||
ID | CTGF（全长+N末端）（pM） | CTGF（全长）（pM） | CTGF（N末端）（pM） |
1 | 1226 | 213 | 1013 |
2 | 1004 | 187 | 817 |
3 | 432 | 35.4 | 397 |
4 | 1422 | 278 | 1144 |
5 | 938 | 39.9 | 898 |
6 | 682 | 73.2 | 609 |
7 | 1123 | 168 | 955 |
8 | 849 | 45.5 | 804 |
9 | 857 | 60.6 | 796 |
mean | 826 | ||
SD | 221 | ||
【结果】
IPF患者血浆中N末端的CTGF量明显高于健康者。
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FAQ
◆关于样品
Q1：血液样品建议使用何种抗凝剂？
A1：参考以下文献，肝素血浆中CTGF（N末端）的值高于EDTA血浆和柠檬酸盐血浆。因此，不建议使用肝素作为抗凝剂。
A1：<参考文献> Miyazaki, O. et al.: Ann. Clin. Biochem., 47, 205(2010).
A1： Subtraction method for determination of N-terminal connective tissue growth factor
◆关于试剂盒
Q1：试剂盒中的抗体是否有销售？
A1：FUJIFILM Wako供应以下固相化抗体。
A1：抗CTGFModule 1，单克隆抗体（30D2）（产品编号：018-27423）
检测抗体不单独销售。FUJIFILM Wako可供应Module 2识别抗体（产品编号：015-27433）及Module 4识别抗体（产品编号：019-27453），但与本试剂盒使用抗体的克隆不同。
Q2：标准品是如何标价的？
A2：标准品参考以下文献进行标价。
A1：Miyazaki, O. et al.: Ann. Clin. Biochem., 47, 205(2010).
◆关于试剂盒的使用
Q1：本试剂盒进行检测时所需的试剂、器具和设备？
A1：使用本试剂盒需要以下试剂、器具和设备。
A1：● 纯净水（蒸馏水）
A1：● 标准溶液/样品稀释用试管
A1：● 清洗液稀释用玻璃器具（量筒/烧杯）
A1：● 可更换吸头的移液器（可准确移液10 μL以及 200~500 μL的一次性吸头）
A1：● 可连续分注100 μL的移液器
A1：● 具有吸水性的毛巾（清洗后去除孔板残留液体）
A1：● 涡旋振荡器
A1：● 微孔板振荡器（约500~800 rpm）
A1：● 96孔板用清洗器（建议使用）或清洗瓶
A1：● 读板器 (450±10 nm / 600~650 nm)
A1：● 数据处理软件
Q2：两个试剂盒必须配合使用吗？
A2：若检测CTGF (N末端, Module 1-2)，需两个试剂盒配合使用。
A1：若只检测CTGF（全长），只需购买CTGF(全长) ELISA试剂盒。
Q3：96次用可检测几个样品？
A3：标准品使用16孔（n=2），n=1时可检测80个样品，n=2时可检测40个样品。
Q4：试剂盒可分多次使用吗？
A4：可以，孔板设计为可每8个孔进行分割的样式，试剂盒包含充足数量的标准品。
A4：但是多次使用时，每次实验前都需重新绘制标准曲线，并且可检测的样品数量也会减少。另外，孔板封条只有4片，请根据需求进行使用。
参考文献
1. | Biernacka, A., Dobaczewski, M., and Frangogiannis, N. G.: Growth Factors, 29(5), 196(2011). |
2. | Mori T., et al.: J. Cell Physiol., 181(1), 153(1999). |
3. | Kono, M. et al.: Clin. Chim. Acta, 412, 2211(2011). |
4. | Miyazaki, O. et al.: Ann. Clin. Biochem., 47, 205(2010). |
| 产品编号 | 产品名称 | 产品规格 | 产品等级 | 备注 |
| 290-84701 | CTGF(Full) ELISA Kit Wako CTGF (全长) ELISA试剂盒 Wako |
96次用 | 免疫化学用 | - |
| 292-84901 | CTGF(Full+N-terminal region) ELISA Kit Wako CTGF(全长+N末端) ELISA试剂盒 Wako |
96次用 | 免疫化学用 | - |
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