利用磁珠富集磷酸化蛋白

Phos-tag™ MG-Bead

Phos-tag™ MG-Bead是 phos-tag与涂有琼脂糖的磁珠连接而成的产品。磁珠上的phos-tag与磷酸化蛋白结合后，通过使用磁力架吸附磁珠即可完成富集。除蛋白外，还可以富集其他带有磷酸基团的物质。

使用此产品的论文

用于磷酸化SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的分离

Yoko, I. et al. : Journal of Proteomics., 255 104501 (2022)

◆使用方法

1. 将5 ~ 50 µL Phos-tagTM MG-Bead磁珠加入1.5 mL试管中。

2. 使用磁力架收集管内磁珠，并去除保存液。

3. 用0.1 M Bis-tris-AcOH缓冲液使磁珠重悬，并摇匀。重复此步骤两次。

4. 取50 ~ 200 µL溶解于0.1 M Bis-tris-AcOH缓冲液的样品于1.5 mL试管中，并在室温下摇匀孵育 3 分钟。

5. 用磁力架收集管内磁珠，并去除穿透液。

6. 使用0.1 M Bis-tris-AcOH缓冲液重悬磁珠，摇匀30秒，用磁力架收集管内磁珠，并去除洗涤液。重复此步骤三次。

7. 用蒸馏水使磁珠重悬，摇匀30秒。震荡后，用磁力架收集管内磁珠，去除洗涤液。

8. 为洗脱与磁珠结合的磷酸化化合物，加入pyrophoshate缓冲液，并摇匀30 秒。重复此步骤五次。

9. 分析洗脱的磷酸化化合物。

*关于操作所需的相关溶液成分，请点击参阅本产品的protocol。

◆应用实例

富集磷酸化肽段

磁珠量：50 µL

样品：胰蛋白酶消化的 β-酪蛋白溶液（包括具有 1 个磷酸化位点和 4 个磷酸化位点的肽）

洗涤缓冲液：0.1 M Bis-tris-AcOH （含0.1 M NaCl） pH6.8

洗脱缓冲液：0.1 M Na₄P₂O₇ – 0.1M AcOH pH7.0

分别对样品溶液（sample）、穿透液（FT），洗脱液（E1）进行HPLC分析，结果如图所示，在洗脱液（E1）中成功检出两种磷酸化肽、。

FT：上述操作步骤5中的.穿透液。

E1：上述操作步骤8的洗脱液。

分离NAD和NADP

磁珠量：50 µL

样品：含有 NAD(100 nmol) 和 NADP(100 nmol) 的溶液

洗涤缓冲液：0.1 M Bis-tris-AcOH pH6.8

洗脱缓冲液：0.1 M Na₄P₂O₇ – 0.1M AcOH pH7.0

分别对各步骤的溶液进行HPLC分析，并对其结果进行解析。如图，穿透液和洗涤液中检测出NAD，通过反复洗涤，可以分离出高纯度的NAD。并在洗脱液检测出NADP，通过重复洗脱步骤，可以分离出纯度超过 99% 的NADP。

FT：上述操作步骤5的穿透液。

W1~W3：上述操作步骤6.的洗涤液。数字为洗涤次数。

W4：上述操作步骤7.的洗涤液。

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