骨吸收检测试剂盒

Bone Resorption Assay Kit

◆原理

       本产品是用于检测骨吸收作用的试剂盒，已预先铺在板上的磷酸钙首先与荧光素标记的硫酸软骨素结合（FACS），加入破骨细胞后，通过细胞的呼吸作用将 FACS 从磷酸钙层释放到培养基中，检测培养基中的荧光强度来评价骨吸收作用。此款试剂盒可用于骨生理代谢、药物评价等方面研究。

◆优点・特色

●　简单快捷——仅需检测荧光强度变化即可评估骨吸收能力

●　操作方便——观察骨吸收后形成的凹洞，仅需移除细胞。

●　准确清晰——可透过显微镜观察细胞形态，并可用图像软件分析吸收效果。

●　创新有效——使用标定荧光的磷酸钙来取代传统的牙质骨片。

●　产品已灭菌，即可使用

◆案例・应用

<药物作用巨噬细胞 RAW264 细胞系后实验检测>

注意：（1）使用无酚红培养基。（2）使用时请避光。

骨吸收检测板/试剂盒【常见问题】

Q1：    培养基的使用量？
A1：    BONE RESORPTION ASSAY KIT 48x2（CSR-BRA-48X2KIT）按照说明书，该试剂盒需要用分化培养基处理板子。1个板子，48孔，
            每个孔需用 0.5 mL 分化培养基处理，每个孔加入细胞（细胞含有 0.5 mL分化培养基）。1个48孔板合计需要的分化培养基是48 mL。

            2个48孔板，是 96 mL分化培养基。

           Osteoclast Culture Kit V-2 （PMC-OSC12-COS ）这个试剂盒中含有25 mL的分化培养基。所以，Osteoclast Culture Kit V-2 

         （PMC-OSC12-COS ）里面的分化培养基25 mL是远远不够用于BONE RESORPTION ASSAY KIT 48x2（CSR-BRA-48X2KIT）的检测。

           Osteoclast Culture Kit V-2 （PMC-OSC12-COS ）即便里面的分化培养基不含酚红，也需要另外配置。

Q2：    如何配置不含酚红的培养基？
A2：   不含酚红的分化培养基配方：
       1）alpha-MEM（不含酚红），10%胎牛血清，1%双抗，50 ng/mL M-GSF,15 ng/mL RANKL。Osteoclast Culture Kit V-2 中用的也是

            alpha-MEM。
       2）DMEM/F12（不含酚红），10%胎牛血清，1%双抗，50 ng/mL M-GSF,15 ng/mL RANKL。Osteoclast Culture Kit V-2 中用的也是

            alpha-MEM不同。BONE RESORPTION ASSAY KIT 48x2 （CSR-BRA-48X2KIT）试剂盒中用到的。

Q3：    在细胞孵育（５~６天）后，最佳的荧光检测时间是什么？什么时候荧光强度开始减弱？ 什么时候必须检测荧光强度？

A3：    最佳荧光检测时间取决于细胞和培养状态。所以我们推荐继续使用少量的条件培养基，研究荧光强度的上升曲线。

Q4：    板的保质期多久？

A4：    距离发货时间１年。

Q5：    板的荧光强度会随时间而减弱吗？

A5：    避光情况下，结合磷酸钙（CaP）的荧光标记硫酸软骨素（FACS）的荧光强度稳定。然而，部分荧光标记硫酸软骨素（FACS）在有培养

　　　  基或者PBS时会被洗脱到培养基内。

Q6：    如果我用胰酶消化细胞做 qPCR，磷酸钙（Ca-P）是否影响胰酶消化或者 qPCR 结果？

A6：    非常抱歉，我们没有实验过，也没有相关数据。

Q7：    我如何检测 pit？与 TRAP 检测类似吗？需要检测 pit 的深度和宽度吗？（检测 pit 的面积不等于检测破骨细胞消化的 pit 体积）

A7：     Pit 检测（骨吸收活性）与 TRAP 检测不是很相似。按照说明书，pit 检测中细胞的面积是在移除细胞后对板进行拍照测量。实际上，如您

             所说体积不应该在 pit 检测中测量。检测体积也比较困难。因此，pit 面积或者 pit 数目经常检测。

Q8：    我该如何洗涤细胞？用缓冲液？检测荧光强度的 pit 实验后。

A8：    用５%的次氯酸钠处理５分钟将细胞从板上移除，然后用水洗涤板，晾干。

Q9：    可用 TECAN 的活细胞影像仪器对板进行实时检测？

A9：    通常，我们会在新的 96 孔板内收集条件培养基，检测荧光强度。我们没有在培养过程中检测荧光强度。

Q10：    根据说明书，需要使用非酚红培养基培养细胞，我是否可以用其他不含酚红的培养基（不是说明书上提到的培养基）？

              这种培养基是否对细胞有不利影响？能否推荐其他不含酚红的培养基。我比较担心在磷酸钙（CaP）包被的培养板上培养细胞，不含酚红

              的 DMEM 或者其他培养基不能很好的支持细胞培养５天。在将细胞接种在磷酸钙（CaP）包被的培养板之前，我是否可以用含酚红的培

              养基培养细胞？我想培养 RAW264.7 细胞和 U937 细胞。另外，５%的次氯酸钠是否也包含在试剂盒里？

A10：    在我们培养体系中，不更换培养基可以培养６天。如果客户担心６天培养的问题，我们推荐他试试在正常培养板中进行同样的培养，确认

              是否可以诱导破骨细胞。

              非常抱歉，我们这边没有用除了 DMEM/F-12、αMEM 之外的培养基。可以试试，确认是否能诱导破骨细胞。在最初培养的时候，可以

              用含酚红的培养基。但在检测时，需要更换成不含有酚红的培养基。

              ５%的次氯酸钠不包括在试剂盒内。

              推荐使用 Sodium Hypochlorite Solution（197-02206，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.，）

Q11：    是否可用这种板检测正常骨髓破骨细胞分化实验？能否在实验结束时用 TRAP 染色细胞？

A11：    "BONE RESORPTION ASSAY PLATE" 可用于检测破骨细胞的骨吸收活性。破骨细胞的骨吸收活性与破骨前体细胞（骨髓或者 RAW264.7

              细胞系）的骨吸收活性的差别是可以评估的。请注意在使用骨髓来源的破骨前体细胞时细胞 的选择。在骨髓实验中，该实验可能由于含

              有其他杂质导致进展不顺利，还可能在破骨细胞诱导时，需要检查 M-CSF 和 RANKL 的浓度是否足量。

              TRAP 染色，我们没有这方面的经验，但是可以同时进行骨吸收检测和 TRAP 染色。破骨细胞吸收后，细胞仍然在细胞板上贴壁。如果希

              望结果清晰，我们推荐单一实验。

Q12：    是否可以兼容转染实验？是否会破坏包被？如果兼容的话，推荐什么转染方法？

A12：    在磷酸钙包被的板（CaP）上没有进行转染的实例。

              磷酸钙在细胞板上贴壁很牢。所以，如果没有酸或者强的外力，不会发生剥离。

              如果客户是做 siRNA 实验，推荐在转染后使用 CaP 板。因为核酸会吸收 CaP，导致转染效率差。

Q13：    板是保存在室温还是４℃？

A13：    室温和４℃ 都可以保存。

Q14：    如果不是一次性用完所有的孔，这块板还能再用吗？因为整块板都会放在 37℃ 培养细胞。

A14：    基本上我们不能保证上述使用的效果。但是，如果没有污染的话，未使用的孔都可以再使用。另外看，包被的CaP会和二氧化碳培养箱的

              湿气反应，可能会有点影响。

Q15：    是否可用于破骨细胞的检测（说明书是检测的 RAW 细胞）？如何用影像分析软件测量 pit 检测吸收？

A15：    非常抱歉，我们没有检测过不同分化的（成熟的）破骨细胞。如果含有其他细胞，会导致操作困难。

TRAP 染色试剂盒常见问题

Q16：    该款试剂盒是否可用于石蜡包埋的组织？

A16：    非常抱歉，我们没有用这个做过石蜡包埋的组织。如果样品含有福尔马林的话，也不能用。

Q17：    操作说明书是可以做 10×96 孔板实验。能否介绍一下使用６孔板的步骤？

A17：    请使用 96 孔板的 30 倍试剂。比如显色试剂的量是 1.5 mL 。

Q18：    是否可以染巨噬细胞？

A18：     可以。

Q19：    进行免疫荧光实验时，是否可以一起使用？如果可以，请告知实验流程。

A19：    我们没有用该试剂盒同时进行免疫荧光实验。

Q20：    如果显色底物溶解的话，在４℃可以保存多久？

A20：    非常抱歉，显色底物不能溶解后保存。最好现配现用。显色底物提供３mg/瓶，有 10 瓶。

Q21：    能够提供小包装？

A21：    目前不行。

【相关文献】

RANKL-dependent increase of fluorescence intensity of the conditioned medium (left) and pit area (right) from RAW264 cells in fluoresceinamine-labeled chondroitin sulfate (FACS)/ calcium phosphate (CaP)-coated plates (mean ± SD, n = 3, **: p<0.001).

The inhibitory effects of Pamidronate and β-Estradiol on calcium phosphate resorption induced by RANKL (100 ng/mL) were measured by fluorescence intensity (left) and pit area (right) (mean ± SD, n = 3, *:p<0.05, **: p<0.001).

（摘自参考文献[4]）